El empleo del potencial metabólico microbiano para la eliminación de contaminantes ambientales, provee tanto una alternativa económica como una seguridad para su disposición en sitios de depósito (vertederos), así como una posibilidad mayor por emplear estrategias fisicoquímicas efectivas.
Se han logrado aislar microorganismos capaces de realizar una mineralización de una variedad de compuestos tóxicos bajo condiciones de laboratorio. Sin embargo, la acumulación en el ambiente de compuestos altamente tóxicos y persistentes, provoca que la diversidad metabólica natural de los microbios autóctonos sea insuficiente para proteger a la biosfera de una contaminación antropogénica.
Análisis clásicos y biodiversidad natural
Muchos reactivos recalcitrantes contienen elementos estructurales o sustitutos que rara vez o nunca ocurren en la naturaleza (xenobióticos). Probablemente a causa de lo novedoso de estos compuestos, los microorganismos no han logrado desarrollar vías metabólicas adecuadas para su biodegradación.
Una degradación efectiva y eficiente considera varios elementos: biodisponibilidad de los sustratos, su difusión y su transporte dentro de las células. Aunado a estos factores, los organismos deben encontrarse presentes en los sitios en donde se requiere de su actividad de biorremediación y bajo condiciones ambientales manipuladas o condicionadas.
Nuevas informaciones sobre vías metabólicas
Las actividades microbianas de origen natural son y han sido el punto de partida para cualquier aplicación biotecnológica. De ahí que sea esencial realizar un aislamiento de especies bacterianas que presenten una capacidad metabólica novedosa y una elucidación, tanto desde un enfoque bioquímico como genético de las vías de degradación de diversos compuestos químicos.
En la actualidad se han logrado importantes avances acerca de la caracterización bioquímica y genética de dichas enzimas y de sus respectivos genes. Por ejemplo, la dioxin-dioxigenasa obtenida a partir del microorganismo Sphingomonas sp. cepa RW1, es una de las primeras enzimas capaces de realizar una dioxigenación angular, es decir, una oxigenación al nivel de dos átomos de carbono vecinales; uno de los cuales está comprometido en uno de los puentes que se forman entre los anillos aromáticos. Los genes responsables ya han sido caracterizados.
Aun cuando la vía de degradación de los hidrocarburos poliaromáticos ya ha sido caracterizada relativamente en aislados microbiológicos de origen terrestre, todavía se desconocen los mecanismos mediante los cuales las bacterias marinas transforman dichos compuestos. Nuevos géneros como Cytoclasticus y Neptunomonas hasta hace poco fueron aislados. Sus respectivos genes revelaron una relación distante con respecto de los genes responsables de la síntesis de las naftaleno dioxigenasas producidas por cepas de Pseudomonas y de Burkholderia, formando subgrupos en la familia del gene nah.
Los avances no se limitan únicamente al estudio del proceso inicial de activación de las dioxigenasas sobre los anillos aromáticos, también centran su atención en el entendimiento de los mecanismos desarrollados por enzimas específicas sobre metabolitos de degradación aromática.
Biodisponibilidad de los xenobióticos
Una de las razones principales que justifican una prolongada persistencia de los compuestos orgánicos hidrófobos en el ambiente, es su limitada solubilización-biodisponibilidad. Una posibilidad de resolver este escollo y por lo tanto su degradación, sería la aplicación de biosurfactantes. Estas moléculas consisten a la vez tanto de una parte hidrofílica como una hidrófoba.
Por un lado se supone que su papel natural es el de incrementar el área superficial de sustancias de crecimiento de naturaleza fisicoquímica insoluble e hidrófoba, mejorando su biodisponibilidad al aumentar su solubilidad aparente o mediante la desabsorción de superficies y de la regulación entre la adherencia o no adherencia por parte de los microorganismos a diferentes superficies.
La combinación de la producción de surfactantes junto con las capacidades degradativas de una sola especie bacteriana, podría ofrecer avances en los procesos de biorremediación in situ, no sin antes considerar que aún son necesarios estudios introspectivos relacionados con la organización genética y el proceso de regulación de la producción de los surfactantes.
Muchos compuestos aromáticos son tomados por los microbios mediante sistemas de transporte dependientes de energía. Recientemente varios científicos enumeraron 18 familias de proteínas transportadoras dentro de la superfamilia más facilitadora. Existen evidencias sobre un sistema de transporte activo de la molécula neutra e hidrófoba del naftaleno.
Propiedades importantes de organismos
Varios contaminantes ambientales como el tolueno, son altamente hidrófobos. Son tóxicos a los microorganismos debido a su acumulación y a una ruptura de las membranas celulares de éstos, inactivándolas y anulando su deseable actividad biodegradativa aun en microorganismos capaces de realizar estos procesos.
En la actualidad se han encontrado evidencias de que en sitios muy contaminados con hidrocarburos aromáticos, se esperaría que las especies tolerantes a solventes fuesen las primeras en establecerse, colonizar el sitio y volverse predominantes en el proceso de remoción de dichos contaminantes.
Los cambios en la hidrofobicidad de la superficie celular no son solamente un solo mecanismo de defensa en contra de los solventes orgánicos, sino que además se relacionan con el proceso de adhesión de las bacterias a las superficies. Para los propósitos de biorremediación, una dispersión de las células inoculantes en su introducción es deseable, ya que evitaría el taponamiento de los pozos de extracción. Por lo tanto, las especies deficientes en la capacidad adhesiva, serían mucho más ventajosas y en el caso de especies mutantes se ha logrado ya su producción.
Mejoras en bacterias y plantas transgénicas
Una estrategia que nos permite desarrollar microorganismos capaces de mineralizar compuestos PCB, consiste en combinar actividades metabólicas complementarias. Específicamente, combinar la vía oxidativa del cloro y la transformación de bifenilos (codificados por genes bph) a clorobenzoato mediante una vía degradativa de éste. Así, especies híbridas han sido manipuladas por la ingeniería genética y mediante apareamientos conjugativos de organismos apropiados o con la introducción de los genes bph en organismos degradadores del clorobenzoato, todo ello gracias a la utilización de una vía degradativa de clorobenzoatos y el uso de los clorocatecoles correspondientes.
Mediante la clonación y la expresión de los genes que codifican la síntesis de las enzimas que realizan una descloronización de los clorobenzoatos en posiciones orto y para en la especie cometabolizante de bifenilos y de clorobifenilos Comamonas testosteroni VP44, se obtuvieron derivados capaces de crecer y de realizar una descloronización completa del 2,4-clorobifenilo.
Fragmentos catabólicos o rutas metabólicas pueden ser ensamblados o insertados en especies bacterianas convenientes. La acumulación de metales pesados por medio de vegetales, es ejemplo de una bien caracterizada tecnología de biorremediación y estas plantas pueden ser complementadas con información genómica adicional de origen bacteriano.
Plántulas transgénicas del «poplar» (pulpa, resina o madera de determinado árbol alto y delgado) que expresan la síntesis de la mercúrico-reductasa de origen bacterial, germinan y crecen en presencia de iones de mercurio, en concentraciones que normalmente son tóxicas y logran liberar y expulsar al mercurio elemental mediante un transporte del mercurio absorbido en los suelos.
Por otra parte, la planta Arabidopsis thaliana fue manipulada genéticamente con el objeto de lograr la expresión modificada de la organomercurial-liasa. Posteriormente se observó que las plantas transgénicas obtenidas, crecían vigorosamente dentro de una amplia gama de concentraciones de organomercuriales altamente tóxicos, probablemente esto dio lugar a la formación del mercurio en su estado de ionización, que debió acumularse en los tejidos vegetales disponibles.
Biotecnología genómica ambiental
Un problema general que se presenta en los procesos de biorremediación, es causado por la utilización de cepas recombinantes cuyos genes clonados son inestables una vez insertados en plásmidos. El desarrollo de minitransposones ha permitido una integración estable de los genes dentro de los cromosomas de cepas recipientes.
Recientemente se pudo confirmar la eficiencia del método en donde se emplean minitransposones, en cepas recombinantes altamente estables, construidas a base de casetes de expresión genética que contienen genes que codifican la síntesis de oxigenasas insertadas dentro de los cromosomas. Además, los marcadores genéticos resistentes a antibióticos han sido ya reemplazados por marcadores construidos a partir de determinantes resistentes a la telurita.
Mediante un método elegante se han eliminado todos aquellos tags recombinantes heredados en etapas de clonación previas y se ha logrado obtener cepas casi naturales las cuales contienen exclusivamente aquel segmento del ADN que codifica el fenotipo deseado.
La información acumulada sobre la estructura y función de las enzimas catabólicas y de sus vías metabólicas, ofrece una posibilidad de perfeccionamiento en un futuro próximo. Una mutagénesis racional sitio-dirigida para mejorar la función enzimática es posible, siempre y cuando se disponga de la caracterización detallada de una enzima dada y de su estructura de cristal.
Además existen otros métodos de intercambio y adquisición de módulos del ADN (fragmentación al azar de una población de genes mutantes de una cierta familia seguida de un reensamblaje igualmente al azar) que fueron desarrollados y permiten ahora construir un amplio espectro de proteínas quiméricas y de sus variantes.
Sin embargo, sólo se encuentran a disposición algunos métodos de monitoreo de la variedad de los derivados, como aquel en el cual la reacción deseada puede ser relacionada con un fenotipo de carácter obvio o a una reacción de coloración.
Con el fin de asegurar la biodisponibilidad de un contaminante, se requiere conocer varios aspectos: la sobrevivencia, la actividad y el transporte de los microorganismos añadidos o de su material genético, y finalmente, conocer también las condiciones ambientales en general.
Aún más, las capacidades y actividades intrínsecas del sitio de interés, deben ser caracterizadas tanto para señalar los cuellos de botella presentes en los procesos de biodegradación, como para recuperar el potencial intrínseco en aplicaciones de carácter biotecnológico. Las técnicas de ingeniería genética ofrecen la posibilidad de equipar a aquellos microorganismos que lograron sobrevivir y permanecer activos una vez introducidos en ciertos ambientes, con el potencial catabólico deseado.
Los métodos de amplificación del material genético por la reacción de síntesis en cadena del ADN (PCR), utilizan la ADN polimerasa y permiten llevar un seguimiento de las bacterias introducidas al ambiente e igualmente de sus genes catabólicos.
Las hibridizaciones ADN:ADN que emplean sondas génicas PCR-marcadas, pueden ser utilizadas para la caracterización de ciertos ambientes y de parámetros relacionados con un potencial metabólico o de la vía metabólica predominante en ellos.
La extracción y caracterización del ARNm, proporciona datos relevantes concernientes a la actividad metabólica de los microorganismos y puede ser útil en la identificación de los genes que predominan en un sitio determinado.
Se han identificado poblaciones dominantes de microorganismos degradadores del fenol presentes en lodos y los estudios realizados demuestran que por medio de un plaqueo directo o de un cultivo quimiostático, es posible lograr su aislamiento a diferencia del cultivo batch de enriquecimiento.
La identificación de nuevas vías de degradación demuestra que el potencial biodegradador de los microorganismos no está aún bien elucidado. Por ejemplo, se tienen varias estrategias que permiten establecer comparaciones entre los resultados obtenidos mediante métodos de cultivo independientes (en donde se analizan los fragmentos 16S del ADNr y los genes que codifican la síntesis de enzimas como la fenol-hidroxilasa) con aquellos que emplean cultivos de enriquecimiento.
Finalmente, cabe señalar que se encuentran disponibles nuevos métodos que permiten caracterizar miembros activos que predominan en comunidades microbianas de importancia biotecnológica.
Como ejemplos, podemos citar una incorporación de marcadores a base de isótopos en fosfolípidos de ácidos grasos de importancia taxonómica (38) o la hibridización in situ por fluorescencia para la visualización de grupos específicos de bacterias mediante microautorradiografía y una visualización de sus miembros activos.
Resulta evidente el hecho de que apenas comenzamos a entender y, por lo tanto, a explotar totalmente la diversidad natural que caracteriza a los procesos de biodegradación y de biorremediación.
